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應用研究
海浪牌動態濁度法鱟試劑的使用特點說明
Date: 2017-07-19 15:53:41
湛江博康海洋生物有限公司質量管理部推薦
一、概述定量法鱟試驗，快速、簡單、經濟、結果準確、定量范圍廣，是目前世界醫藥衛生領域開展的一項專一的細菌內毒素檢查方法。
定量法鱟試驗的特點：
1、通過反應曲線，直觀顯示鱟試劑的反應過程，可以鑒別是內毒素反應還是非內毒素假陽性反應；
2、快速、準確檢測樣品中的內毒素含量，有利于藥品生產過程中的質量控制；
3、可以檢測臨床病人體液中的內毒素含量，作為疾病診斷的依據；
4、操作簡單、可靠性高；
5、儀器波長660nm。
二、鱟試劑
定量法鱟試劑不同于凝膠法鱟試劑，它對鱟血細胞提取物的純度、溶解度、澄明度以及對內毒素反應的線性關系都有較高要求。
質量重點考察指標：
1、無菌；
2、細菌內毒素；
3、最低檢測限；
4、支間差異；
5、標準曲線的有效性考察；
6、穩定性考察。
三、復溶與分裝
鱟試劑在復溶前，須輕彈試劑瓶使瓶壁上的試劑粉末落到瓶底（注：殘留在試劑瓶蓋或瓶壁上的微量粉末可忽略不計），小心打開試劑瓶蓋或折斷曲頸部，避免接觸污染。使用前按標示量加入檢查用水復溶試劑，可將定量鱟試劑在旋渦混合器上點觸2-3秒促進定量鱟試劑的充分溶解，將復溶好的定量鱟試劑全部取入同一試管（或安瓿）混合均勻后，分裝到定量分析專用試管中，一般每管分裝0.1ml。
四、標準曲線的有效性考察
取細菌內毒素國家標準品1支，按規定制成至少3個等比系列稀釋液（建議選用4個等比系列稀釋液，稀釋度建議選用4），為λ1、λ2、λ3和λ4，每一濃度平行做3支。另做2支陰性對照，當試驗結束，陰性對照結果OD值不超過儀器及試劑推薦值（如0.02）時，將全部數據進行回歸分析。
1、直線LgT=a+bLgC的相關系數|r|≥0.9800，建議選用|r|≥0.99，標準曲線更精確（見左下圖）。
2、等比系列稀釋液中不同濃度的內毒素的反應曲線應有明顯區別，其中內毒素濃度越高，動力學曲線越陡峭，曲線位于坐標左側；內毒素濃度越低，動力學曲線越平緩，曲線位于坐標右側，從左到右時間間隔應逐步遞增（見左上圖）。
3、每個點應做3支平行管，平行管的變異系數（CV%）應不大于10%，建議選用5%的標準。變異系數主要由三個因素引起：儀器、試劑和操作。
六、最大有效稀釋
中國藥典2015年版規定頭孢曲松鈉（規格：2mg/支）的內毒素限值是0.20EU/mg（P253頁）。最大有效稀釋倍數（MVD），按照中國藥典2015年版提供的公式來計算：
3、每個點應做3支平行管，平行管的變異系數（CV%）應不大于10%，建議選用5%的標準。變異系數主要由三個因素引起：儀器、試劑和操作。
六、最大有效稀釋
中國藥典2015年版規定頭孢曲松鈉（規格：2mg/支）的內毒素限值是0.20EU/mg（P253頁）。最大有效稀釋倍數（MVD），按照中國藥典2015年版提供的公式來計算：
MVD＝CL/λ
λ在光度測定法中為所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。
如，湛江博康海洋生物有限公司定量法鱟試劑（批號：1612101）最低檢測限為0.015EU/ml時，制做標準曲線的最低內毒素濃度為0.0312EU/ml。其方法是先用5ml檢查用水溶解頭孢曲松鈉制得C＝2.0mg/5ml＝0.4mg/ml；其中 L=0.20EU/mg，λ=0.0312EU/ml，計算：
MVD＝CL/λ
＝0.4×0.20 /0.0312
＝2.56倍
七、定量檢查法
按2015年版《中國藥典》通則1143細菌內毒素檢查法“光度測定法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測。
試驗必須符合以下四個條件方為有效：
1、當使用儲存的標準曲線時，必須選擇等于或接近標準曲線中點的內毒素濃度作為陽性對照，并且陽性對照誤差必須在±25%以內；
2、反應曲線必須滿足內毒素反應曲線的特征：反應曲線呈S型、速度曲線大約為正態分布。
3、做回收率試驗時，樣品陽性對照管應含有等于或接近標準曲線中點的內毒素濃度，若標準曲線的內毒素濃度點為等比系列其第二個濃度即為中點濃度，如：2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml，則0.5EU/ml即為中點濃度。內毒素的回收率要在50%～200%的范圍內，最好控制在80%～150%。如陽性對照的檢測值與加入值差別較大時，建議以絕對回收率判斷試驗的有效性。
4、陰性對照的反應時間應大于標準曲線最低濃度的反應時間。
若供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規定的內毒素限值，判供試品符合規定。若大于或等于規定的內毒素限值，判供試品不符合規定。
分析討論：
1、通過分析反應曲線，內毒素呈S型特征曲線（動態濁度法鱟試劑質量標準(草案)），部分樣品（葡萄糖注射液、Vc注射液、塑瓶裝葡萄糖注射液、血制品、抗凝血酶和血液透析器等）可能呈非內毒素反應，檢測數據無效。（見下圖）
如，湛江博康海洋生物有限公司定量法鱟試劑（批號：1612101）最低檢測限為0.015EU/ml時，制做標準曲線的最低內毒素濃度為0.0312EU/ml。其方法是先用5ml檢查用水溶解頭孢曲松鈉制得C＝2.0mg/5ml＝0.4mg/ml；其中 L=0.20EU/mg，λ=0.0312EU/ml，計算：
MVD＝CL/λ
＝0.4×0.20 /0.0312
＝2.56倍
七、定量檢查法
按2015年版《中國藥典》通則1143細菌內毒素檢查法“光度測定法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測。
試驗必須符合以下四個條件方為有效：
1、當使用儲存的標準曲線時，必須選擇等于或接近標準曲線中點的內毒素濃度作為陽性對照，并且陽性對照誤差必須在±25%以內；
2、反應曲線必須滿足內毒素反應曲線的特征：反應曲線呈S型、速度曲線大約為正態分布。
3、做回收率試驗時，樣品陽性對照管應含有等于或接近標準曲線中點的內毒素濃度，若標準曲線的內毒素濃度點為等比系列其第二個濃度即為中點濃度，如：2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml，則0.5EU/ml即為中點濃度。內毒素的回收率要在50%～200%的范圍內，最好控制在80%～150%。如陽性對照的檢測值與加入值差別較大時，建議以絕對回收率判斷試驗的有效性。
4、陰性對照的反應時間應大于標準曲線最低濃度的反應時間。
若供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規定的內毒素限值，判供試品符合規定。若大于或等于規定的內毒素限值，判供試品不符合規定。
分析討論：
1、通過分析反應曲線，內毒素呈S型特征曲線（動態濁度法鱟試劑質量標準(草案)），部分樣品（葡萄糖注射液、Vc注射液、塑瓶裝葡萄糖注射液、血制品、抗凝血酶和血液透析器等）可能呈非內毒素反應，檢測數據無效。（見下圖）
2、內毒素反應速度大約為正態分布，先快后慢，最后停止反應，反應過程中有反應速度最高峰，如分析該反應過程發現反應速度與內毒素不符，可以判斷該反應為非內毒素反應，檢驗數據無效。（見下圖）
3、本使用方法僅適用于湛江博康海洋生物有限公司生產的海浪牌動態濁度法鱟試劑。
【注意事項】
1、 本試驗用具要求無菌無熱原，建議使用本公司提供的吸嘴、試管等試驗耗材。
2、 試驗結束，未獲得反應數據按0計算。
3、 制做標準曲線時，必須用中檢所提供的細菌內毒素標準品。
4、 細菌內毒素標準品必須用砂輪在瓶頸上部劃痕開啟，并用酒精棉球消毒。
5、 儀器波長660nm。
【注意事項】
1、 本試驗用具要求無菌無熱原，建議使用本公司提供的吸嘴、試管等試驗耗材。
2、 試驗結束，未獲得反應數據按0計算。
3、 制做標準曲線時，必須用中檢所提供的細菌內毒素標準品。
4、 細菌內毒素標準品必須用砂輪在瓶頸上部劃痕開啟，并用酒精棉球消毒。
5、 儀器波長660nm。
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