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          應用研究
          正確理解細菌內毒素檢查法中的“水”
          Date: 2017-07-19 16:23:01

          編者注:細菌內毒素檢查法在我國已開展了近二十年,經過許許多多專家學者的努力,目前該行業已經取得了非常重要的成果。但是在實際應用的過程中該領域仍然有許多的問題,這些問題的存在嚴重阻礙了該行業的進一步發展。
                本文作者對這些問題進行了詳細的總結,希望他的研究對讀者的工作有所幫助!  
            

                試驗器皿處理不符合要求或被污染導致細菌內毒素試驗時陽性不成立呈陰性。許多客戶對這種現象不理解,他們認為在細菌內毒素檢查過程中,器皿被污染的結果必然導致陰性對照呈陽性,但試驗結果恰恰與他們的想象相反。要正確理解這個問題,首先要正確理解鱟試劑與內毒素的反應機理,鱟試劑與內毒素的反應為一系列酶反應,生物酶反應受許多因素的干擾。在日常工作中,我們要特別注意一些因素對試驗結果的影響,如PH值、器皿的潔凈度以及環境因素等。
                這里我們重點談論“水”對鱟試驗結果的影響,這里的水包括:試驗器皿洗滌用水和細菌內毒素檢查用水。
                1 2015年版《中國藥典》對水的定義
                2015年版《中國藥典》通則0261“制藥用水”描述“本版藥典中所收載的制藥用水,因其使用的范圍不同而分為飲用水、純化水、注射用水及滅菌注射用水。
                純化水 為飲用水經蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的供藥用的水。不含任何附加劑,其質量應符合二部純化水項下的規定。
                純化水可作為配制普通藥物制劑用的溶劑或試驗用水,不得用于注射劑的配制與稀釋。
                純化水有多種制備方法,應嚴格檢測各生產環節,防止微生物污染。用作溶劑、稀釋劑或精洗用水,一般應臨用前制備。
                注射用水 為純化水經蒸餾所得的水,應符合細菌內毒素試驗要求。注射用水必須在防止內毒素產生的設計條件下生產、貯藏及分裝。
                注射用水可作為配制注射劑用的溶劑或稀釋劑及注射用容器的精洗。
                滅菌注射用水 為注射用水照注射劑生產工藝制備所得。主要用于注射用滅菌粉末的溶劑或注射液的稀釋劑。其質量符合滅菌注射用水項下的規定。”
                2 器皿的洗滌用水
                2010年版《中國藥品檢驗標準操作規范》310頁細菌內毒素檢查法“實驗準備”規定:“將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡,然后取出將洗液瀝干,用自來水將殘留洗液徹底洗凈,再用蒸餾水反復沖洗三遍以上,空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器中,放置入烤箱中,除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素。” 
                按照2015年版《中國藥典》凡例第二十二條規定“試驗用水,除另有規定外,均系指純化水。”應該特別注意,該規程明確規定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗。”有的客戶使用反滲透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿,結果試驗中所有的陽性對照都為陰性,復核鱟試劑靈敏度時試驗結果誤差較大,這主要是由于純化水和蒸餾水的制備方法不同所造成的。由于制備方法不同,反滲透法制備的純化水中離子濃度高于蒸餾水,而這些陰陽離子經250℃高溫干烤不可能被破壞,這些離子對鱟試劑酶反應有較強的抑制作用,造成陽性對照不成立。
                常見錯誤:部分客戶使用純化水沖洗試驗用玻璃器皿,更有甚者居然只用自來水沖洗,然后干烤以除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素。這樣處理玻璃器皿做細菌內毒素實驗的主要現象:陽性對照不成立,靈敏度復核結果也不成立。這是目前所知陽性對照不成立和靈敏度復核結果不成立的主要原因。
                解決辦法:取一個潔凈的盆用蒸餾水沖洗,洗凈后盛一盆蒸餾水。將已“用自來水洗凈”的玻璃器皿放入盆中,反復沖洗,洗完后更換另盛一盆蒸餾水繼續洗,這樣更換蒸餾水最少三遍。洗凈后放入適宜的密閉金屬容器中,放置入烤箱中250℃恒溫至少60分鐘,除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素。
                為了保證試驗結果的準確性和檢驗報告的權威性,我們應該嚴格遵守操作規程,用蒸餾水沖洗鱟試驗用玻璃器皿。
                3 細菌內毒素檢查用水
                細菌內毒素檢查用水與滅菌注射用水的區別:酸堿度、細菌內毒素和干擾因素。
                3.1 酸堿度 鱟試劑與內毒素反應的最適宜pH在6.58.0,故鱟試驗時,美國、日本藥局方以及中國藥典2015版規定檢品必須調節PH值6.08.0。細菌內毒素檢查用水的pH值一般控制在6.0~8.0;滅菌注射用水的pH值應控制在5.0~7.0。由于大部分藥品呈弱酸性,故細菌內毒素檢查用水的pH值有利于鱟試驗。
                3.2 細菌內毒素 細菌內毒素檢查用水每1ml中含內毒素量至少應小于0.015EU,定量法用細菌內毒素檢查用水每1ml中含內毒素量應小于0.005EU;滅菌注射用水每1ml中含內毒素量應小于0.25EU。細菌內毒素檢查用水本身的內毒素必須足夠低,不應對試驗結果產生影響,如果用滅菌注射用水代替檢查用水做鱟試驗,由于滅菌注射用水中內毒素含量較高,滅菌注射用水和被測樣品中內毒素疊加可能產生假陽性,造成企業直接經濟損失。因內毒素含量的差別,故不能用滅菌注射用水代替檢查用水做鱟試驗。
                3.3 干擾因素 細菌內毒素檢查用水必須對鱟試劑、內毒素標準品和鱟試驗不得有干擾;滅菌注射用水對此無要求。滅菌注射用水要求安全穩定,但滅菌注射用水是否會影響細菌內毒素標準品的活性和穩定性?滅菌注射用水是否對鱟試驗產生增強或抑制作用?很少有人對此做過長期的考察。經考察驗證部分滅菌注射用水對鱟試驗存在很強地抑制作用,如果用滅菌注射用水代替檢查用水做鱟試驗,可能產生假陰性,造成內毒素漏檢,直接威脅用藥安全。因滅菌注射用水干擾因素的存在,故不能用滅菌注射用水代替檢查用水做鱟試驗。
          如果能保證洗滌用水、洗滌方法和試驗用水的準確,鱟試驗中陽性對照不成立的可能性基本不存在,除非使用的標準品不規范。為了保證試驗結果準確,我們必須做到:

                1 熟悉標準及行業規范;
                2 使用合格的產品及標準品;
                3 嚴格按操作規程進行操作。

          參考文獻:

                (1)國家藥典委員會,中華人民共和國藥典(四部)。北京:中國醫藥科技出版社,2015:通則1143
                (2)中國藥品生物制品檢定所,中國藥品檢驗標準操作規范(2010年版)。北京:中國醫藥科技出版社,P310。
                (3)王思理,胡冠時,汞立青.細菌內毒素檢查法及其應用[M].北京:氣象出版社,2003:6,10.
                (4)莫水晶. ,細菌內毒素檢查法與論壇[M].北京:湛江博康海洋生物有限公司,2007:6(1)
                (5)莫水晶. ,細菌內毒素檢查法與論壇[M].北京:湛江博康海洋生物有限公司,2006:5(1)
           

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