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          應用研究
          抗生素治療導致細菌內毒素釋放的研究進展
          Date: 2017-07-20 15:11:34

          作者:李晉 彭毅志 肖光夏 吳其林
           
                                        單位:610083 成都,成都軍區總醫院燒傷科(李晉、吳其林)
                                                   重慶第三軍醫大學西南醫院燒傷研究所(彭毅志、肖光夏)


                由革蘭陰性(Gˉ)細菌引起的各種感染仍是目前臨床上主要的并發癥和死亡原因之一。即使在應用各種廣譜、高效抗生素治療感染取得巨大進步的今天,對抗菌治療中產生的一系列嚴重反應,如發熱、中毒性休克及多器官功能衰竭(MOF)等,仍然沒有取得防治的根本性進展。其中抗生素治療中導致G細菌釋放內毒素(lipoplysaccharide,LPS),以及由其引起的嚴重損害存在著十分復雜的作用機理沒有完全闡明,是一個主要原因1。

                一、LPS及其作用原理
                1.LPS結構特點:LPS為Gˉ細菌外膜中的脂多糖成分。它由三部分組成:(1)O-特異性側鏈;(2)核心多糖;(3)類脂A。O-特異鏈由20~40個重復單位組成,每個重復單位由3~7個糖分子組成。它是細菌表面的主要抗原,決定型的特異性。核心多糖可分為連接O-特異鏈的外核部分和連接類脂A的內核部分。核心多糖相對穩定,同一菌屬結構相同。內核部分含有庚糖和2-酮基-3-脫氧辛酸(KDO)兩種特殊的糖類分子。它們在LPS結構中起著連結多糖與類脂的作用。類脂A由2個葡萄糖脂、磷酸鹽和一定量的脂肪酸組成,為LPS分子中最穩定的部分;各類Gˉ細菌均相同,它是LPS的主要毒性成分。目前認為在LPS中只有類脂A和KDO具有毒性。LPS的共同抗原在類脂A/KDO區,常被O-特異鏈遮蓋而處于隱蔽狀態2,3。
                2.LPS與結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)、糖蛋白CD14:LBS為血清中一種糖蛋白,分子量為60000U,在肝細胞合成。LBP對各類細菌的類脂A均具有高度親和力,能與LPS結合形成LPS-LBP復合物,促進LPS與單核巨噬細胞上的CD14結合。正常情況下含量較低,在應激狀態下其含量可明顯增加。CD14是一種分子量為55000 U的糖蛋白,借助磷酸酰肌醇聚糖錨吸附于單核巨噬細胞膜表面,為LPS-LBP復合物的受體。當LPS-LBP復合物與CD14結合后,激活有關酶系統,促進單核巨噬細胞合成、分泌多種細胞因子,如:TNF-α、IL-1、IL-6等,TNF-α被公認為引起內毒素休克、MOF等炎癥反應的主要因子。目前認為LPS的毒性作用,主要是通過LBP和CD14這一途徑實現的。因為LPS-LBP復合物誘導巨噬細胞產生TNF-α的能力是單一LPS的1000倍4,5。
                3.LPS釋放與炎癥反應:早在一個世紀前,Jarish和Herxheimer就發現梅毒患者用汞劑治療后可出現發熱等癥狀加劇的反應,稱為雅-赫二氏反應(Jarish-Herxheimer raction)。自五十年代以來,在抗生素治療的患者中,因Gˉ細菌裂解釋放出大量LPS造成臨床癥狀惡化的證據,先后在布魯氏菌、腦膜炎雙球菌和Gˉ細菌腸膿毒癥的患者中得到證實。自那以后,大量的實驗證實,抗生素治療中可以引起Gˉ細菌LPS釋放,作用于單核巨噬細胞介導多種炎癥因子釋放,如:TNF-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、前列腺素、凝血素、干擾素、血小板基激活因子等。這些因子適量時可激活免疫系統,產生殺滅微生物的有益作用。過量時可引起機體嚴重病理生理反應,表現為發熱、低血壓、心動過速、休克、MOF及死亡6,7。
            二、不同種類抗生素影響Gˉ細菌LPS釋放的主要機理
            1.抑制蛋白質合成類抗生素與LPS釋放:氨基糖甙類、氯霉素類和喹諾酮類抗生素能夠抑制細菌蛋白質的合成,導致生長停止、增殖減慢而死亡。因而這類抗生素在多數實驗中顯示了釋放LPS緩慢,釋放量較其它種類抗生素低的特性。環丙沙星由于能引起細菌絲狀改變,仍可導致LPS的大量釋放。另外一些研究發現,G菌的外膜表面存在鈣、鎂陽離子。正常情況下它們起連接LPS與磷脂分子的橋梁作用,能穩定LPS分子。當去除這些離子后,LPS會變得不穩定而釋放出來。慶大霉素和環丙沙星可與鈣離子絡合,引起LPS釋放。這種作用能被過量的鎂離子所抑制。使細胞成分改變,造成膜的損傷,也是氨基糖甙類抗生素的作用機制之一。一些研究者認為,氯霉素引起的腦膜炎雙球菌釋放LPS,也是由于細胞膜的損傷,造成膜成分改變,使細菌細胞壁喪失了LPS的結合力所致。環丙沙星引起的細菌絲狀改變的機理不明810。

                2.干擾細胞膜通透性類抗生素與LPS釋放:Gˉ細菌細胞壁較薄而疏松,粘肽只占細胞壁的10%~20%。而含有大量的LPS、脂蛋白和雙層磷脂的外膜,其內側為含類脂質的胞漿膜。多粘菌素B等多肽類抗生素由肽鍵連接的環狀高分子化合物組成,結構中有游離的-NH2和-COOH。帶正電的-NH2與Gˉ細菌胞膜中磷脂上帶負電的PO4-3結合,改變了細胞膜的通透性,使菌體內的氨基酸、核酸、K+等成分外漏而死亡。LPS中的類脂A也含有PO4-3,故認為多肽類抗生素具有中和LPS的能力。許多實驗已證實多粘菌素B作用于Gˉ細菌后,僅引起低而緩和的LPS釋放。細菌釋放出的LPS激活單核巨噬細胞釋放TNF-α,這一作用可被多粘菌素B抑制。如在用B型嗜血流感桿菌為模型的動物實驗中,單用頭孢他啶治療時,血中的TNF-α顯著增加,加用多粘菌素B后便抑制了約98%的TNF-α釋放。表明多粘菌素B能夠中和及減少Gˉ細菌釋放LPS,因而阻斷了由其引起的TNF-α釋放。最近發現氨基糖甙類也能結合LPS,但作用明顯不如多粘菌素B11,12。
                3.青霉素結合蛋白與LPS釋放:傳統理論認為,β-內酰胺類抗生素的主要殺菌機制是抑制細菌細胞壁的合成。因為這類抗生素都含有一個β-內酰胺環,與細菌N-乙酰胞壁酸五肽的最后二肽,即D-丙氨酰酸相似,能竟爭結合轉肽酶,形成青霉噻唑酶,使其失活,轉肽過程中止,使細菌細胞滲透壓增高裂解而死亡。青霉素結合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs)是細菌胞漿膜上的一種微小蛋白質,分子量在30000~150000 U之間。各種細菌PBPs譜不同,約3~10種,主要有6種,按分子量由大到小排序為:PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5、PBP6。有的還有亞型:如PBP1a、PBP1b、PBP1c等。通過對底物分析,PBP13與肽多糖轉肽酶和葡萄糖轉移酶活性有關;PBP46與羧肽酶活性有關?,F已明確,PBPs實際上是有關粘肽合成的一類催化酶-青霉素敏感酶(penicillin sensitive enzymes)。PBPs數量極少,僅占細胞膜蛋白總量的1%,每個細胞只有20~30個分子。個別的PBPs性質已比較清楚,如PBP5為一種D,D-羧肽酶,分子量50000 U。通過一較短親水肽(20~30個氨基酸)的羧基端嵌入在胞漿膜上,其氨基端和活性部位向外。每一種PBPs與β-內酰胺抗生素作用的詳細機制仍不清楚。目前比較重視的是PBP13。因為PBP1與細胞快速裂解有關;PBP2和PBP3與細菌形態改變有關,這些都與LPS釋放有關13。
                不同的抗生素對不同的PBPs的親和力不同,同種抗生素在不同的濃度下對PBPs的結合類型也不同。如:伊米配能在1~2倍MIC(最低抑菌濃度)時,優先與PBP2結合,使細菌成為滲透壓穩定的大球形細胞,沒有裂解;濃度大于5倍MIC時,與PBP1親和力增加,導致迅速裂解。頭孢他啶在低濃度時優先與PBP3結合,使細菌變成絲狀;高濃度時也與PBP1結合,使細菌迅速裂解。初步認為其作用機理是,PBP1能控制細菌生長和菌體增大,是細菌生長的重要蛋白,主要功能為維持細胞形態,與抗生素結合可致細菌迅速裂解。PBP3能使細菌分裂停止,但不影響生長,故使細菌變成細長的絲狀,其長度可達原體積的30倍。PBP2的作用機理尚不清楚,可能與維持細胞有關。在一項以頭孢他啶(與PBP3結合)和伊米配能(與PBP2結合)的體外實驗表明,頭孢他啶引起的LPS釋放量大于伊米配能10倍。對于這種現象,目前認為與PBP3的結合使細菌發生絲狀變,生長沒有停止,隨著菌體的伸長LPS含量也不斷增加,當PBP1受抑止致細菌裂解時,便釋放出大量的LPS,其量明顯高于與PBP2結合的伊米配能引起的球形變(因生長停止)。兼有上述兩種變化的抗生素已在實驗室中觀察到,如美洛配能(meropenem)在濃度≤MIC時,與PBP3結合,引起絲狀變,釋放較多LPS,與頭孢他啶相似;在濃度>2倍MIC時,與PBP2結合,出現球形變,釋放較少LPS,與伊米配能相似。但多數實驗表明,美洛配能主要與PBP3結合。同時也證明,伊米配能引起的LPS釋放及由此引起的TNF-α、IL-6等介質釋放量均低于優先與PBP3結合的抗生素,如:頭孢他啶、美洛配能、頭孢三嗪等1417。
                三、LPS血癥防治研究進展
                抗生素的治療,雖然能有效殺滅入侵的病原體,但隨之而來的大量LPS釋放給許多嚴重感染性疾病的救治,造成了極大困難,目前臨床上尚缺乏有效地防治辦法。盡管近年來已發現了許多新的拮抗劑,但多數仍停留在探索階段。另外,隨著對抗生素作用機制認識的加深,已經發現一些抗生素具有中和或減少LPS釋放的能力。
                1.免疫治療:(1)單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb):這類抗體種類較多,主要為IgM和IgG兩種,分別針對O-特異鏈、核心多糖和類脂A發揮作用。如:HA-1A、E5、McAb5B10、McAb8G9、McAb1B6、McAb3D10等。其中,較早應用于臨床的HA-1A由于療效差,存在嚴重不良副作用,因而已停用。E5(抗類脂A IgM抗體)臨床應用顯示了良好效果,能降低LPS和TNF-α,提高生存率。但對細胞結合型LPS無效。這是因為疏水的類脂A位于深部,受O-特異鏈遮蔽。但McAb1B6(Ig2A)能結合深部的類脂A。這些抗體通過中和LPS、促進單核細胞吞噬LPS及內在化作用發揮了良好的抗LPS作用。但這些抗體只能早期應用,過晚由于TNF-α已被激活釋放,因而不能改善LPS引起的炎癥反應18。(2)聯合免疫:由于單克隆抗體僅針對LPS,不能對已產生的細胞因子起作用。因而采用多種McAb聯合應用,比單一McAb更有效。Cross等19進行了由O-特異鏈McAb、J5多克隆抗血清和抗TNF-αMcAb組成的三聯免疫動物實驗。在沒有用抗生素的情況下,單用任何一種制劑的生存率為25%~43%;任何2種制劑聯合應用的生存率為50%~60%;3種制劑聯合應用的生存率為77%。
                2.重組LPS中和蛋白:重組LPS中和蛋白(recombinant endotoxin neutralizing protein,rENP)以鱟制取,對各種細菌的LPS均有高度親和力。動物實驗表明rENP能夠顯著降低抗生素治療中的LPS和Gˉ細菌膿毒癥的病死率,其療效明顯高于HA-1A20。
                3.LPS拮抗劑:E5531為無毒性的紅桿菌屬外膜中的類脂A成分,已由實驗室合成。E5531能竟爭結合LPS受體,抑制LPS介導的細胞毒作用。動物實驗表明,E5531與抗生素聯合使用,能明顯降低LPS的致死率21。
                4.粒細胞抗菌蛋白:從多形核白細胞的嗜天青顆粒中,已分離出3種抗菌蛋白質:(1)殺菌性通透性增加蛋白(bactericidal permeability-increasing protein,BPI);(2)抗菌15 Ku蛋白(antibacterial 15000 U protein isoforms,P15s);(3)中性白細胞肽(nautrophil peptides,NPs)。BPI分子量55000 U,具有強大的殺菌、中和LPS和抑止TNF-α分泌的能力。P15s和NPs也具有一定的殺菌、中和LPS的能力,但對長鏈LPS(S型)無作用。3種蛋白經比較實驗,證明它們的作用強度為:BPI遠大于P15s,而后者與NPs相同。由于PBI的全部抗菌活性基團位于25000 u區域,因此已人工合成重組23000 U的BPI,即rBPI23。經臨床實驗證明,rBPI23能顯著降低LPS、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10水平,減少了中性白細胞脫顆粒作用,因而抑制了LPS引起的生物效應。在4周的臨床實驗期中,任何受試者體內沒有出現抗rBPI23抗體,肝、腎、骨髓功能無異常。除了部分受試者有短暫的皮膚潮紅外,無其它任何副作用,應用前景十分良好22。
                5.具有中和、減少LPS釋放類抗生素:(1)多粘菌素B:由于其獨特的化學結構,人們已發現多粘菌素B具有中和LPS的能力。許多實驗已證明,該藥單獨或與其它抗生素聯合應用,均能減少LPS的釋放。但由于該藥抗菌譜窄,有嚴重腎毒性副作用,因而限制了該藥的應用范圍。為此,人們已將多粘菌素B制成了復合制劑,如:多粘菌素B-右旋糖酐70、多粘菌素B-IgG等。該類復合制劑降低了腎毒性,仍保留了殺菌力和中和LPS的能力23,24。(2)新型β-內酰胺類抗生素許多體內外實驗已經證實,凡與PBP2親和力強的β-內酰胺類抗生素僅導致較低的LPS釋放。已發現的這類抗生素有伊米配能、克拉維酸、氮卓脒青霉素、頭孢諾米、頭孢吡肟等。目前證明效果最好的是伊米配能。一項臨床對照實驗表明,LPS毒血癥患者,經治療4小時后,伊米配能(與PBP2結合)組的3例患者LPS水平已降低;頭孢他啶(與PBP3結合)組的4例患者LPS水平沒有降低,其中2例患者的LPS水平增加了。正在開發的新一代碳青霉烯類抗生素L-627(biapenem),不需與脫氫肽酶Ⅰ抑制劑聯用,殺菌作用更強,副作用更輕,尤其對大腸桿菌PBP2、PBP4,綠膿桿菌PBP1a、PBP2、PBP4顯示出強的親和性。其特性明顯優于第一代的伊米配能。而另2種已上市的碳青霉烯類抗生素美洛配能和帕尼配能(penipenem),主要與PBP3結合,無降低LPS的作用。選用優先與PBP2結合的抗生素,既能殺菌,又能減少LPS的釋放,可以提高嚴重感染性疾病的救治水平14,16,17,25,26。
           
          中華外科雜志 1998年第0期第36卷 綜述
           

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